Los dispositivos de microingeniería permiten largas

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5006 (2022) Citar este artículo

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La dinámica y la conectividad de los circuitos neuronales cambian continuamente en escalas de tiempo que van desde milisegundos hasta la vida de un animal. Por lo tanto, para comprender las redes biológicas, se requieren métodos mínimamente invasivos para registrarlos repetidamente en el comportamiento de los animales. Aquí describimos un conjunto de dispositivos que permiten grabaciones ópticas a largo plazo del cordón nervioso ventral (VNC) adulto de Drosophila melanogaster. Estos consisten en ventanas transparentes y numeradas para reemplazar el exoesqueleto torácico, implantes compatibles para desplazar los órganos internos, un brazo de precisión para ayudar a la implantación y una etapa con bisagras para atar moscas repetidamente. Para validar e ilustrar nuestro conjunto de herramientas, (i) mostramos un impacto mínimo en el comportamiento y la supervivencia de los animales, (ii) seguimos la degradación de las terminales nerviosas mecanosensoriales del órgano cordotonal durante semanas después de la amputación de la pierna, y (iii) descubrimos ondas de ingestión de cafeína de actividad neuronal. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo abre la investigación de adaptaciones de circuitos motores y premotores en respuesta a lesiones, ingestión de drogas, envejecimiento, aprendizaje y enfermedades.

Los tejidos neurales son notablemente plásticos, adaptándose a los cambios en los estados internos y en respuesta a la exposición repetida a señales ambientales sobresalientes. En neurociencia, los estudios fisiológicos de fenómenos de larga escala de tiempo, incluida la formación de memoria y la neurodegeneración, a menudo se han basado en la comparación de datos agrupados en animales muestreados en múltiples puntos de tiempo. Sin embargo, la cuantificación de las diferencias entre condiciones con este enfoque adolece de variabilidad interindividual. Por lo tanto, las grabaciones longitudinales del mismo animal serían ideales para descubrir cambios adaptativos en la dinámica funcional y estructural de los circuitos neuronales. Se deben superar importantes desafíos técnicos para realizar estudios a largo plazo en animales individuales, incluida la minimización de los insultos experimentales.

Con el advenimiento de los registros neuronales basados ​​en microscopía, en particular, las imágenes de calcio de dos fotones1, se ha vuelto posible registrar de forma crónica circuitos cerebrales in vivo de una manera mínimamente invasiva mediante el aprovechamiento de dispositivos crónicos. Por ejemplo, las tecnologías de ventana craneal se desarrollaron por primera vez para estudiar la neocorteza de ratón2 y desde entonces se han mejorado para adquirir campos de visión de imágenes más grandes3 y más profundos4, así como grabaciones de mayor duración5. De manera similar a los roedores, las imágenes cerebrales también se pueden realizar en la mosca adulta que se comporta, Drosophila melanogaster6,7, un organismo modelo popular que es (i) genéticamente tratable, (ii) tiene un sistema nervioso pequeño con muchas menos neuronas que los roedores y ( iii) genera conductas sociales, de navegación y motrices complejas8,9,10,11.

Los enfoques recientes han permitido registros crónicos a largo plazo de las neuronas en el cerebro de la mosca12,13,14. De manera similar a la obtención de imágenes de la neocorteza de los roedores con una ventana craneal15, el cerebro de la mosca puede hacerse ópticamente accesible mediante la eliminación de la cutícula de la cápsula de la cabeza y los tejidos subyacentes6. Para realizar imágenes a largo plazo o repetidas, este orificio se puede cubrir con pegamento UV curable13, silicona de dos componentes16 o cubreobjetos cortado manualmente12. Sin embargo, las técnicas y tecnologías utilizadas para realizar imágenes a largo plazo en los cerebros de ratones y moscas no son adecuadas para registrar circuitos motores en la médula espinal de los mamíferos o el cordón nervioso ventral (VNC) de los insectos. Al igual que la médula espinal, que está oculta por el hueso vertebral, el músculo y la lámina dorsal17, el acceso óptico al VNC requiere la extirpación de múltiples órganos y tejidos suprayacentes, incluidos los músculos de vuelo, los cuerpos grasos, el intestino y la tráquea. Las cirugías invasivas en la médula espinal permiten la implantación de una cámara18 o una pinza19. Sin embargo, el pequeño tamaño de la mosca limita el uso de dispositivos implantables convencionales, lo que representa un desafío importante para descubrir los principios generales del control motor a través de la investigación del VNC manejable experimentalmente, un tejido nervioso que está organizado en forma tosca como la médula espinal de los mamíferos20, y cuyos principios de control se asemejan a los que se encuentran en los vertebrados21,22.

Recientemente desarrollamos un enfoque de disección que brinda acceso óptico al VNC en animales atados y que se comportan mediante la eliminación quirúrgica y genética, en el caso de los músculos de vuelo indirecto, de los tejidos suprayacentes23. Sin embargo, esta técnica es invasiva, requiere la resección de los órganos torácicos y deja abierta la cavidad torácica durante la obtención de imágenes. Esto excluye las grabaciones que duran más de unas pocas horas. En consecuencia, ha sido imposible realizar mediciones repetidas de los circuitos premotor y motor en la misma mosca para arrojar luz sobre cómo estos circuitos se adaptan con el tiempo. Las herramientas existentes para imágenes cerebrales a largo plazo son insuficientes para imágenes VNC a largo plazo. A diferencia de las imágenes del cerebro, no se pueden pegar13 ni cortar manualmente los cubreobjetos12 para cubrir el orificio torácico después de la disección. En cambio, se necesita un enfoque más preciso y reproducible que asegure que la hemolinfa no se escape del tórax. Además, para obtener acceso óptico al VNC, se deben desplazar con suavidad pero con firmeza los grandes órganos y tejidos torácicos suprayacentes sin interrumpir su función.

Aquí, describimos un conjunto de dispositivos de microingeniería que abordan todos estos desafíos para permitir grabaciones repetidas y a largo plazo del VNC de Drosophila durante más de un mes. Estos dispositivos abordan los desafíos únicos asociados con el estudio de organismos modelo pequeños (la mosca mide ~ 2–3 mm de largo) que requieren una manipulación extremadamente suave. Específicamente, diseñamos (i) un manipulador ("brazo") que nos permite apartar y mantener temporalmente en su lugar los órganos torácicos, (ii) implantes flexibles que eliminan la necesidad de extirpar quirúrgicamente los órganos torácicos para obtener acceso óptico al VNC, (iii) una ventana de polímero transparente que encierra la cavidad torácica y está numerada para permitir que las moscas individuales se distingan entre sí en las sesiones de imágenes, y (iv) una etapa de montaje para atar moscas de manera suave pero firme para grabaciones repetidas. Proporcionamos descripciones detalladas de cómo fabricar y utilizar todas estas herramientas para facilitar su replicación y adopción por parte de otros laboratorios.

Demostramos que los implantes y las ventanas tienen un impacto mínimo en la locomoción y la supervivencia de los animales, y que permiten grabaciones neuronales durante al menos un mes. Luego, ilustramos los casos de uso de nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo en dos estudios de prueba de concepto. Primero, medimos longitudinalmente la degradación de la inervación de las neuronas mecanosensoriales de las extremidades del VNC durante dos semanas después de la extracción de la pierna. En segundo lugar, ilustramos cómo, al dejar intactos los órganos torácicos, se puede medir el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica de la población neuronal. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes torácicas a largo plazo permite el estudio longitudinal repetido de la dinámica neural estructural y funcional en los circuitos premotores y motores. Estas herramientas también pueden usarse de manera más general para estudiar otros tejidos torácicos, incluidos los músculos de vuelo indirecto, el intestino y la tráquea.

Desarrollamos dispositivos de microingeniería y protocolos de micromanipulación asociados que permiten el acceso óptico al VNC de la mosca durante más de un mes. Las moscas implantadas no muestran deficiencias obvias en su capacidad para alimentarse, caminar, poner huevos o interactuar con otros. (Fig. 1a y Película complementaria 1). El acceso óptico depende de dos componentes principales: un implante compatible y transparente (Fig. 1b) y una ventana torácica transparente (Fig. 1c). La fabricación de ventanas debe ser reproducible y debe ser lo suficientemente grande para sellar de forma segura la abertura torácica para evitar la fuga de hemolinfa. Las soluciones desarrolladas para imágenes cerebrales a largo plazo, como el sellado con pegamento UV13 o una pieza de cubreobjetos cortada manualmente12, no abordan estos desafíos. Diseñamos y microfabricamos una ventana personalizada utilizando un polímero biocompatible, SU-8, mediante fotolitografía (Fig. 1 complementaria). Debido a que los implantes no son necesarios para las imágenes cerebrales a largo plazo, estos tuvieron que diseñarse de novo y sin inspirarse en enfoques anteriores. Nuestros primeros implantes eran estructuras rígidas destinadas a proteger las regiones de interés (ROI) de imágenes VNC de la oclusión por los tejidos torácicos (Fig. 2 complementaria, 'iteraciones 1 y 2'). Las iteraciones posteriores intentaron combinar ventanas torácicas con pilares protectores (Fig. 2 complementaria, 'iteraciones 3 y 4'). Sin embargo, estos dos prototipos iniciales arrojaron tasas de supervivencia prohibitivamente bajas. Logramos un gran avance al adoptar un enfoque completamente diferente: diseñamos implantes en forma de V comprimibles mecánicamente (basados ​​en polímeros) compatibles. A través de varias iteraciones y pruebas, convergimos en el tamaño y el ángulo específicos de estos implantes, lo que resultó en una tasa de supervivencia posterior a la implantación muy alta. Fabricamos estos implantes en masa utilizando litografía blanda, una técnica que se basa en la creación rápida de prototipos y el moldeado de réplicas (Figs. 3 y 4 complementarias).

a Las moscas adultas implantadas se pueden criar en entornos complejos. Un animal implantado---ver ventana torácica dorsal (flecha negra)---interactúa con un animal no implantado. La barra de escala es de 0,5 mm. b Un implante transparente, mecánicamente compatible, microfabricado a partir de Ostemer 220. La barra de escala es de 50 μm. c Una ventana torácica transparente numerada microfabricada a partir de SU-8. La barra de escala es de 50 μm. d Para la implantación, se monta un animal, primero el tórax, en un orificio en una cuña de acero dentro de una etapa de disección. e Una disección de varios pasos permite el acceso óptico a largo plazo al cordón nervioso ventral (VNC). izquierda Se corta un orificio en la cutícula torácica dorsal, que revela el proventrículo (amarillo), la tráquea (cian) y la glándula salival (magenta) que recubren el cordón nervioso ventral (VNC, azul oscuro). Los músculos de vuelo indirecto (IFM) fueron degradados por la expresión específica de tejido de Reaper (Act88F:Rpr)23.Luego, usando un brazo manipulador de diseño personalizado, los órganos torácicos se desplazan, revelando el VNC. medio A continuación, el implante se coloca dentro de este orificio torácico en una configuración estrecha y mecánicamente cerrada. derecho Se extrae el brazo y se libera el implante, lo que hace que se abra y empuje mecánicamente a un lado los órganos que cubren el VNC. Finalmente, se sella una ventana transparente para encerrar el orificio torácico. f Una etapa de montaje nanoimpresa en 3D permite montar y desmontar animales para obtener imágenes repetidas de dos fotones. izquierda El mecanismo monolítico se acciona alrededor de una bisagra flexible. derecha Imagen de muestra de un animal atado a la etapa de montaje, visto desde arriba. g Los animales implantados atados a la etapa de montaje se colocan bajo un microscopio de dos fotones rodeado por un conjunto de cámaras. Esta configuración permite grabaciones simultáneas de actividad neuronal y comportamiento animal. El recuadro muestra una imagen de cámara superpuesta por poses 2D basadas en aprendizaje profundo estimadas con DeepFly3D25. h (fila superior) El tórax dorsal de un animal implantado, visto desde el microscopio de disección, y (fila inferior) su VNC, visualizado mediante microscopía de dos fotones. Este animal expresa GFP en todo el sistema nervioso y se registra a 3 dpi de la izquierda, 14 dpi del medio y 28 dpi de la derecha. Las pilas Z están codificadas por colores de profundidad (100 μm). La barra de escala es de 25 μm.

Para usar estas herramientas, desarrollamos un protocolo de manipulación ilustrado en la Película complementaria 2. Brevemente, primero montamos animales en una etapa de disección quirúrgica usando pegamento curable con UV (Fig. 1d)23. A continuación, cortamos un orificio de forma cuadrada en la cutícula dorsal con una aguja de jeringa de 30G (Fig. 1e - panel izquierdo). Los músculos de vuelo indirecto (IFM) se eliminan posteriormente para crear una abertura torácica para el implante. Para minimizar el impacto de la microcirugía, trabajamos con animales que expresan la proteína inductora de apoptosis, Reaper, específicamente en IFM (Act88F:Rpr). Expresar Reaper da como resultado una rápida degradación del tejido muscular23, el resto del cual puede eliminarse fácilmente con la aguja de la jeringa. Sin embargo, esta línea genética no está estrictamente obligada a hacer uso de estas herramientas. Habiendo expuesto los tejidos torácicos, usamos una aguja de vidrio fina y unas pinzas para separar unilateralmente las fibras traqueales que conectan el intestino y la glándula salival izquierda. Diseñamos un brazo de manipulación personalizado (Fig. 5 complementaria) para empujar los órganos internos (intestino, glándula salival y tráquea) hacia el lado derecho de la cavidad torácica (Fig. 1e - panel izquierdo). Esto permite insertar el implante en un estado cerrado en la cavidad torácica recién accesible (Fig. 1e - panel central y Fig. 4 complementaria). Al liberarse, el implante se abre gradualmente sujetando los órganos contra la pared torácica después de retraer el brazo de manipulación (Fig. 1e - panel derecho). Sellamos la cavidad torácica expuesta pegando una ventana de polímero transparente a la cutícula (Fig. 1e - panel derecho). Estas ventanas tienen grabados en su superficie números únicos que permiten identificar y distinguir entre los animales implantados. A continuación, podemos separar a los animales quitando el pegamento curable con UV que sujeta el escutelo a la etapa de disección, lo que les permite comportarse libremente.

Para facilitar el anclaje repetido y suave de moscas implantadas, imprimimos una etapa de montaje (Fig. 1f y Fig. 6 complementaria) utilizando polimerización de dos fotones24. Este proceso de fabricación tiene la precisión requerida para fabricar características 3D que mantienen a los animales en su lugar de manera confiable. Una vez montados, estudiamos animales usando un sistema de microscopio de dos fotones rodeado por una matriz de múltiples cámaras. Este sistema permite grabaciones simultáneas de actividad neuronal en el VNC23, así como el seguimiento de partes del cuerpo en 3D sin marcadores25 (Fig. 1g). En la gran mayoría de los casos nuestro protocolo de implantación fue exitoso. Con poca frecuencia, los animales implantados exhibieron movimientos específicos de tejidos respiratorios o digestivos que podrían ocluir el VNC durante la obtención de imágenes (Fig. 7 complementaria). La implantación exitosa permitió el acceso óptico al VNC que permaneció prácticamente sin cambios durante un mes. Esto permitió estudios repetidos de la estructura (Fig. 1h y Película complementaria 3) y la dinámica funcional de las poblaciones neuronales en moscas hembra (Película complementaria 4) y macho (Película complementaria 5). Nuestras herramientas de registro a largo plazo también podrían aplicarse para registrar pares de neuronas identificables genéticamente. Ilustramos esto al obtener imágenes de la actividad de un par de neuronas descendentes de ADNa01 durante tres días --- 1, 3 y 5 días después de la implantación (dpi)). Esta actividad se correlaciona con el giro locomotor23 (Fig. 8 complementaria y Película complementaria 6). Aunque aquí nos enfocamos en obtener acceso óptico al neurómero conectivo cervical y protorácico (T1) del VNC (Fig. 1h), nuestro enfoque es general, lo que permite el rediseño y la microfabricación de implantes que permiten la obtención de imágenes de otras regiones del VNC. Como prueba de concepto, modificamos un implante, lo que hizo posible restringir el tejido en el tórax posterior y obtener acceso óptico a los neurómeros T2 y T3 (Fig. 9 complementaria).

Para validar nuestro enfoque de registro a largo plazo, primero estudiamos el impacto potencial de la implantación en la vida útil. Específicamente, medimos la longevidad de tres grupos de animales (n = 40 por grupo): (i) moscas que no fueron manipuladas ("Intactas"), (ii) animales que soportaron anestesia fría, subieron a la plataforma de disección y volaron extracción ("Implantado simulado"), o (iii) moscas que se sometieron al procedimiento de implantación completo ("Implantado"). Para este experimento, el 73 % de los animales implantados sobrevivieron más de 4 h después de la cirugía. Debido a que el procedimiento quirúrgico y de implantación para una sola mosca toma ~ 40 minutos de principio a fin, el rendimiento total, una combinación de este tiempo de implantación y la tasa de supervivencia aguda, fue un animal implantado cada 55 minutos. Entre las moscas que sobrevivieron más de 4 h después de la implantación, observamos una supervivencia máxima de hasta 88 días. Sin embargo, las moscas implantadas exhibieron una mayor mortalidad que los animales intactos en los primeros días posteriores a la implantación (Fig. 2a). En particular, las moscas implantadas simuladas habían aumentado de manera similar la mortalidad en los primeros días, lo que sugiere que el manejo de los animales antes de la implantación, y no la implantación en sí, fue responsable del aumento de la mortalidad. Obtuvimos tasas de supervivencia similares para moscas macho implantadas versus intactas examinadas durante 20 días (Fig. 10a complementaria).

a Curvas de supervivencia para animales hermanos genéticamente idénticos que fueron (i) no manipulados experimentalmente (verde, 'Intacto'), (ii) atados, anestesiados con frío y a los que se les extrajeron las alas (azul, 'Sham implantado'), o (iii) ) preparado para imágenes a largo plazo mediante implantación y la adición de una ventana torácica (naranja, 'Implantado'). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Los comportamientos se compararon mediante el análisis de la dinámica de caminar hacia atrás activado optogenéticamente dentro de una arena de forma cuadrada redondeada. La locomoción se analizó computacionalmente y se trazó, mostrando la trayectoria inicial del animal hacia adelante (cian) y la posterior trayectoria de marcha hacia atrás evocada ópticamente (púrpura). c Velocidades de traducción de animales intactos (arriba), implantados simulados (medio) e implantados (abajo) durante 30 s de comportamiento espontáneo, seguidos de tres períodos de estimulación optogenética de 3 s cada uno (rosa, 'Stim'). Aquí, agrupamos los datos registrados en tres períodos de tiempo durante un mes. Se muestran trazos brutos (grises) y medios (azules). A partir de estas series de tiempo, cada evento de estimulación es un punto de datos a partir del cual calculamos estadísticas de resumen (grupo intacto, n = 286 eventos; grupo implantado simulado, n = 208 eventos; grupo implantado, n = 213 eventos) que incluye (d) el pendiente negativa inicial en la velocidad de traslación (caminar hacia atrás) tras la estimulación optogenética, (e) la distancia de caminata hacia atrás recorrida durante todo el período de estimulación optogenética, y (f) la velocidad de traslación negativa máxima durante todo el período de estimulación optogenética. Un asterisco (*) indica P < 0,05. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego, aunque la implantación no afectó dramáticamente la longevidad, razonamos que colocar un objeto microfabricado dentro del tórax podría tener un impacto negativo al caminar, posiblemente debido a la perturbación de la musculatura relacionada con las piernas, o simplemente a la carga adicional. Investigar esta posibilidad es difícil porque las moscas usan una variedad de formas de andar a diferentes velocidades de marcha y maniobras26. Por lo tanto, para poder realizar un análisis cuantitativo de la marcha, impulsamos la marcha atrás estereotipada mediante la activación optogenética del canal catiónico controlado por la luz, CsChrimson27 expresado en Moonwalker Descending Neurons (MDN)28,29. Estimulamos a los animales en una arena construida a la medida (Fig. 2b) repetidamente en el transcurso de un mes. Esto nos permitió cuantificar y comparar las trayectorias de caminata de moscas intactas, simuladas o implantadas. Primero registramos comportamientos espontáneos durante 30 s, y luego emitimos tres destellos consecutivos de luz naranja de 590 nm durante 3 s cada uno (Fig. 2c, rosa y Fig. 11a complementaria) con un intervalo entre estímulos de 10 s. Estos experimentos se realizaron en los mismos animales en tres períodos de tiempo durante un mes (1–3 días después de la implantación (dpi), 14–16 dpi y 28–30 dpi). Tras la estimulación optogenética, observamos que los animales generaban una marcha atrás rápida que se ralentizaba gradualmente y volvía rápidamente a la línea de base cuando se apagaba la luz (Película complementaria 7). En todas las sesiones de registro, observamos una pequeña diferencia significativa en la aceleración hacia atrás inicial (Fig. 2d) entre el grupo intacto y el grupo con implante simulado (P = 0,044 Kruskal-Wallis con prueba de Conover post-hoc) y entre el grupo 'intacto' y el grupo 'implantado' (P = 0,044). Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticas en las velocidades de traslación de animales intactos, con implantes simulados e implantados en términos de la distancia total recorrida hacia atrás (Fig. 2e) y la velocidad máxima de marcha hacia atrás (Fig. 2f). Se obtuvieron resultados similares al comparar cohortes restringidas por edad. Específicamente, no observamos una diferencia entre los grupos intactos e implantados en la aceleración hacia atrás inicial para cualquier cohorte de edad (1 a 3 ppp, 14 a 16 ppp o 28 a 30 ppp). Las moscas intactas tenían una aceleración hacia atrás ligeramente más lenta (esto puede deberse al contacto entre las patas y las alas que estaban caídas en los animales que expresan Act88F:Rpr). Notamos una diferencia significativa entre ambos grupos de control a 14–16 ppp (Figura complementaria 11b, c) para (i) la pendiente de respuesta de caminar hacia atrás (P = 0.009), (ii) la distancia recorrida caminando hacia atrás (P = 0.0008) ), y (iii) la máxima velocidad de traslación negativa (P = 0.003). La caminata espontánea también se mantuvo cualitativamente sin cambios en las moscas macho implantadas versus intactas (Película complementaria 8). En conjunto, estos resultados sugieren que la locomoción no se ve significativamente afectada por la implantación.

Los circuitos neuronales conservan la capacidad de reorganización estructural a lo largo de la edad adulta30,31. Esto permite adaptaciones en respuesta a lesiones del sistema nervioso32,33,34 y accidentes cerebrovasculares35. De manera similar, en las moscas, la marcha locomotora se reorganiza después de la amputación de una pata36. Sin embargo, el impacto de la amputación en los circuitos de control de las extremidades sigue sin explorarse porque descubrir estos cambios requiere obtener imágenes de la VNC de los animales amputados a lo largo de días o semanas. Aunque, en principio, se podrían agrupar los datos de varios animales en días específicos después de la amputación de la pierna, esto tiene dos deficiencias principales. En primer lugar, la variabilidad entre animales limitaría la capacidad de resolver la degeneración de estructuras neuronales específicas. En segundo lugar, este enfoque consumiría más tiempo y requeriría muchos más experimentos y animales por punto temporal de interés. Por el contrario, la proyección de imagen longitudinal es ideal para descubrir cambios dinámicos en las estructuras neuronales utilizando relativamente pocos animales. Para ilustrar esta posibilidad, seguimos la degradación de los aferentes mecanosensoriales propioceptivos primarios en el VNC después de la amputación de la pierna. Específicamente, visualizamos los terminales axónicos de los órganos cordotonales femorales de la pierna propioceptiva amputados (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) en el neurómero T1 del VNC. Las moscas se implantaron el primer día después de la eclosión (dpe). Luego, un día después de la implantación (1 ppp), realizamos imágenes volumétricas de dos fotones de T1. Los volúmenes consistieron en 100 imágenes tomadas a intervalos de profundidad de 1 μm. Luego, a 2 ppp, se amputó la pata delantera izquierda de cada animal de experimentación cerca de la articulación tórax-coxa (Fig. 3a).

a En animales de experimentación, se amputó la pata delantera izquierda en la articulación tórax-coxa a 2 ppp. b Esquema del sistema nervioso de la mosca. La región VNC de la imagen está resaltada (gris). Proyección z de desviación estándar de volúmenes de imágenes confocales registrados de moscas que (c) se dejaron intactas o (d) se amputaron a 2 ppp (neurópilo teñido con nc82 delineado en gris; fluorescencia GFP en negro). Se tomaron tejidos de animales implantados cuyas patas delanteras izquierdas fueron amputadas. El tejido VNC se eliminó y se tiñó a 20 ppp. La punta de flecha negra indica la región VNC que muestra la mayor diferencia entre la inervación del propioceptor intacto y amputado. La barra de escala es de 50 μm. Proyecciones de intensidad máxima de pilas z registradas de (e) un animal intacto (control) o (f) amputado. Los datos se adquirieron mediante microscopía de dos fotones. Se muestran imágenes tomadas a 1, 2, 4 y 15 ppp. Las imágenes se registran en la imagen de 1 ppp. La barra de escala es de 50 μm. Las puntas de flecha blancas indican terminales de axón degradantes en el VNC de animales amputados. g, h Fluorescencia medida a lo largo de los días utilizando microscopía de dos fotones de animales intactos (n = 5; triángulos azules) o amputados (n = 5; círculos naranja-rojo). Las mediciones indican la fluorescencia media dentro de la región de interés (ROI) (g) cian o (h) púrpura como en los paneles e y f, normalizados y divididos por la fluorescencia media a 1 ppp. Los diagramas de caja indican la mediana, el primer y el tercer cuartil. Comparaciones estadísticas realizadas con una prueba U de Mann-Whitney (bilateral) para la cual un asterisco (*) indica P < 0,05 y dos asteriscos (**) indican P < 0,01. Para el panel g, P = 0,006 (día 4); 0,006 (día 5); 0,009 (día 6); 0,006 (día 7); 0,018 (día 8); 0,009 (día 9); 0,006 (día 10); 0,006 (día 11); 0,009 (día 12); 0,006 (día 13); 0,006 (día 14); 0,006 (día 15). Para el panel h, P = 0,03 (día 4); 0,006 (día 5); 0,009 (día 6); 0,006 (día 7); 0,009 (día 8); 0,009 (día 9); 0,006 (día 10); 0,006 (día 11); 0,009 (día 12); 0,006 (día 13); 0,006 (día 14); 0,006 (día 15). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las moscas implantadas toleraron la amputación de patas y generaron comportamientos normales con las cinco patas restantes (como en la ref. 36). Todos los días durante 15 días, recolectamos volúmenes de imágenes T1 (Fig. 3b) de animales de control ('Intactos') y de animales a los que se les quitaron las patas delanteras izquierdas ('Amputadas'). Realizamos disección, tinción e imágenes confocales de VNC 18 días después de la extracción de la pierna para confirmar que la inervación mecanosensorial del neurómero T1 de VNC persistió en animales intactos (Fig. 3c) pero se degradó en animales amputados (Fig. 3d). Un examen minucioso de los volúmenes de imágenes del microscopio de dos fotones reveló que, en los animales de control, se produjo algo de fotoblanqueo en la región de imágenes durante días (Fig. 3e). Sin embargo, esta disminución de la fluorescencia no fue tan profunda como la reducción de la señal observada en las terminales del axón del órgano cordotonal del neuropilo T1 izquierdo de los animales amputados (Fig. 3f; Fig. 12 complementaria y Película complementaria 9). Al cuantificar los cambios en la intensidad de la señal dentro de regiones específicas de interés (ROI) de las inervaciones del axón cordotonal dentro del VNC 37, medimos una reducción de fluorescencia significativa y altamente reproducible en animales amputados versus intactos (Prueba U de Mann-Whitney, * indica P < 0.05 y ** indica P < 0,01) (Fig. 3g, h).

Además de ser morfológicamente adaptables a lo largo de días y semanas, los circuitos neuronales también modulan continuamente su dinámica en escalas de tiempo más cortas según el estado interno de un animal. En Drosophila, como en los vertebrados, estos estados incluyen hambre38, fatiga39, excitación sexual40, agresión41 y excitación defensiva42. Los estados internos también pueden cambiar tras la ingestión de sustancias psicoactivas, incluida la cafeína43,44,45. La monitorización continua del sistema nervioso es crucial para descubrir cómo se reconfiguran los circuitos durante estos estados cambiantes.

Nuestra técnica anterior para estudiar la dinámica neuronal de VNC en el comportamiento de los animales23 requería la extracción de grandes secciones del intestino, lo que reducía la longevidad de los animales y hacía imposibles las grabaciones a largo plazo que capturaban los cambios en los estados internos. Además, aunque las respuestas gustativas se pueden estudiar en el cerebro46, la eliminación del intestino impide la alimentación y, en consecuencia, no permite investigar cómo la saciedad o la ingestión de sustancias psicoactivas modulan la dinámica neuronal en el VNC. Nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo preserva el intestino, lo que hace posible que los animales sean alimentados durante la microscopía de dos fotones. Por lo tanto, a continuación preguntamos en qué medida nuestras tecnologías podrían usarse para descubrir el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica neuronal.

Las moscas expuestas a dosis bajas de cafeína reducen el sueño43,44 y aumentan la actividad locomotora45. Aquí, preguntamos en qué medida la ingesta de cafeína también podría impulsar cambios globales en la dinámica de la población neuronal. Para probar esto, primero privamos a los animales de 21 a 23 h para fomentar la alimentación. Luego, después de la implantación, registramos la actividad neural en el conector cervical ("Antes de la alimentación"). Mientras se continuaba registrando la actividad neuronal, los animales fueron alimentados (Fig. 4a) con una solución de control ('Solo sacarosa') que contenía 8 mg/ml de sacarosa y 1 mg de colorante de amaranto (para confirmar la alimentación47) (Película complementaria 10), o una solución experimental que también contenía 8 mg/ml o 40 mg/ml de cafeína: "Baja cafeína" (Película complementaria 11) o "Alta cafeína" (Película complementaria 12), respectivamente. Continuamos registrando la actividad y el comportamiento neuronal durante los siguientes 38 minutos. La alimentación se confirmó mediante una evaluación post-hoc de la coloración abdominal por la ingestión de colorante (Fig. 4b). Durante la obtención de imágenes, examinamos la actividad de las neuronas ascendentes y descendentes cuyos axones pasan a través del conector cervical que une el cerebro y el VNC. Para hacer esto, realizamos imágenes de dos fotones de sección transversal coronal del conectivo cervical torácico (Fig. 4c)23 en moscas que expresan el indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6f, así como el marcador anatómico, tdTomato, en todo el sistema nervioso ( Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-opGCaMP6f; UAS-tdTomato/+). Para superar la deformación y la traducción de la imagen que se producen durante los comportamientos de los animales, registramos datos de imágenes utilizando un algoritmo basado en el flujo óptico (ver Métodos)23. Después del registro de imágenes, nuestros datos de imágenes coronales revelan la actividad de los axones que pertenecen a las neuronas descendentes que impulsan las acciones48,49 y las neuronas ascendentes que transmiten los estados conductuales continuos al cerebro50. Estos axones son evidentes como elipses en nuestras imágenes de microscopía de dos fotones (Fig. 4d, puntas de flecha blancas). Estas regiones de interés panneuronales (ROI) son consistentes con las que observamos al obtener imágenes de la actividad neuronal en conjuntos muy dispersos de neuronas descendentes23 y ascendentes50. Esto es más evidente para el par de grandes axones de neuronas descendentes de fibra gigante51 que pasan a través de la línea media dorsal del conectivo cervical (Fig. 4d, asteriscos blancos).

Representación digital de una mosca alimentada mientras se registran las neuronas con un microscopio de dos fotones. b Fotografía de un animal implantado después de ingerir una solución de cafeína de alta concentración durante la microscopía de dos fotones. La punta de flecha blanca indica la coloración púrpura del abdomen, lo que confirma la digestión de una solución de cafeína y sacarosa mezclada con tinte de amaranto. c Esquema del cordón nervioso ventral que indica la región de imagen en el conector del cuello. d Actividad neuronal media codificada por colores durante todos los períodos no locomotores para una mosca antes de alimentarse (los mismos datos que el panel superior en f) incluidas las anotaciones de axones individuales que pasan a través del cuello conectivo (puntas de flecha). Los asteriscos indican la ubicación de los axones de fibra gigante. e Fluorescencia normalizada en todos los axones que pasan por el conectivo del cuello torácico durante registros de 4 minutos antes (azul), durante (verde), poco después (naranja) o mucho después (rojo) de la alimentación. Las moscas se alimentaron con una solución que contenía solo sacarosa (izquierda), sacarosa y una dosis baja (medio) o alta de cafeína (derecha). f Actividad neuronal media codificada por colores durante todos los períodos no locomotores para una mosca antes (arriba), inmediatamente después (centro) o mucho después (abajo) de la ingestión de una solución de cafeína de alta concentración. g Análisis estadístico que indica la presencia de ondas de actividad. La actividad neuronal se normaliza utilizando parámetros calculados sobre la actividad previa a la alimentación (Métodos). Se muestra la actividad normalizada máxima para tres moscas por condición antes, durante y después de la alimentación. La actividad máxima solo aumenta significativamente > 29 min después de la alimentación con una solución de cafeína de alta concentración (pruebas U de Mann-Whitney unilaterales, * indica P < 0,05, P = 0,04 para ambos * informados, ns indica no significativo). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. h El conector cervical en un animal implantado está segmentado en cuatro regiones de interés (ROI). Estos se superponen a una imagen de proyección de tiempo de desviación estándar. i Actividad neuronal normalizada al pico de fluorescencia durante una ola de actividad. Los rastros están codificados por colores como en el panel h. El pico de fluorescencia media en todas las regiones se centra en 0 s. j Hora de pico de actividad en píxeles. El pico de actividad media en todo el conjunto conectivo del cuello es 0 s.

En las tres condiciones experimentales, antes, durante y poco después de la alimentación, observamos fluctuaciones en la actividad neuronal que se asociaron con las épocas de caminar (Fig. 4e, rastros azules, verdes y naranjas; Fig. 13c complementaria, Fly 7 y Complementaria). Películas 10–12). Sin embargo, más de 29 minutos después de la alimentación, observamos grandes ondas de actividad únicamente en moscas alimentadas con la solución de cafeína de alta concentración (Fig. 4e, trazas rojas). Las ondas tenían una amplitud mucho mayor que las fluctuaciones de la actividad neuronal asociadas con la locomoción espontánea. Las ondas de actividad se extendieron por todo el conectivo (Fig. 4f) y se asociaron con una pose rígida general acompañada de micromovimientos (Película complementaria 13). Para cuantificar la presencia y la amplitud de las ondas en diferentes momentos y entre condiciones experimentales, normalizamos la actividad neuronal en el conector cervical en relación con la observada antes de alimentar a cada mosca. Luego calculamos la fluorescencia normalizada máxima (límite superior del percentil del 99%) para los períodos antes, durante y después de la alimentación. Hasta ~ 29 minutos después de la alimentación, el nivel máximo de actividad de las moscas alimentadas con una alta concentración de cafeína no fue significativamente diferente de las moscas alimentadas con sacarosa o una solución baja en cafeína (pruebas U de Mann-Whitney, P> 0.05). Por el contrario, entre 29 y 38 min después de la alimentación, la actividad máxima de cada mosca alimentada con una solución con alto contenido de cafeína fue significativamente mayor que las otras condiciones (pruebas U de Mann-Whitney, P = 0,040), debido a la onda de actividad neuronal (Fig. .4g). La evolución temporal de estas ondas también fue reproducible: la actividad comenzó en el conectivo dorsomedial (azul), luego dorsolateral (verde) y luego ventral (naranja). Las neuronas de fibra gigante (rojas) 51 fueron las últimas en activarse y mantuvieron una alta actividad durante períodos de tiempo más prolongados (Fig. 4h-j y Fig. complementaria 13d-i). Estos datos ilustran que nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo se puede utilizar para investigar cómo la ingestión de alimentos o drogas influye en los estados internos y la dinámica neuronal global.

Aquí hemos descrito dispositivos de microingeniería que abren la investigación integral y longitudinal del control motor en el comportamiento de los animales. Específicamente, permitimos grabaciones de dos fotones a largo plazo de tejidos en el tórax adulto de Drosophila, incluidos los circuitos premotores, sensoriales y motores que se dirigen y residen dentro del VNC. Nuestro kit de herramientas está diseñado para abordar los desafíos únicos de la grabación a largo plazo de VNC en comparación con enfoques más simples que permiten grabaciones longitudinales de neuronas en el cerebro12,13: consta de (i) un brazo micromanipulador, (ii) un polímero- implante blando para desplazar los órganos torácicos, (iii) una ventana de polímero transparente numerada que se puede fabricar de manera reproducible para sellar la abertura torácica, y (iv) una etapa de sujeción compatible que permite un montaje suave y repetido alrededor del tórax de los animales para imágenes de dos fotones. Juntas, estas herramientas amplían la ventana de tiempo de registro neuronal de solo unas pocas horas23 a más de un mes, sin reducir significativamente la vida útil de los animales implantados ni perturbar significativamente su comportamiento locomotor. Hemos ilustrado varios casos de uso para nuestro enfoque de imágenes a largo plazo, que incluyen (i) grabaciones de semanas de duración de la morfología neuronal, actividad panneuronal y actividad neuronal dispersa, (ii) degradación de semanas de las proyecciones de neuronas sensoriales de las extremidades al VNC de una extremidad amputada, y (iii) cambios globales en la actividad neuronal después de la ingestión de drogas.

Nuestros experimentos de longevidad confirmaron que la esperanza de vida de las moscas implantadas era similar a la de los animales intactos. Sin embargo, las curvas de supervivencia se desplazaron para las moscas implantadas y simuladas debido al exceso de mortalidad en los primeros días posteriores a la cirugía. Esto sugiere que esas pérdidas iniciales podrían deberse al manejo quirúrgico y no estar específicamente relacionadas con la implantación. De acuerdo con esto, nuestros estudios de caminar hacia atrás no revelaron cambios claros en las métricas locomotoras entre los animales de control y los implantados. Sin embargo, en el futuro, sería importante confirmar el impacto mínimo de la implantación en comportamientos más complejos como el cortejo y el cruce de brechas.

En un primer estudio de caso de nuestro conjunto de herramientas, investigamos la degradación anatómica de las proyecciones cordotonales al VNC durante dos semanas después de la amputación de la pierna. Allí observamos una marcada degradación de las terminales de las neuronas mecanosensoriales en la primera semana después de la amputación. La evolución temporal de esta degradación fue heterogénea entre las regiones de interés, lo que concuerda con la existencia de distintas poblaciones de células cordotonales 37 que pueden tener diferentes niveles de resistencia a la degradación. Alternativamente, algunas terminales pueden surgir a través de proyecciones ascendentes desde T2 (pierna media) o T3 (pata trasera) y, por lo tanto, no se ven afectadas directamente por la amputación de la pata delantera. Drosophila se ha utilizado previamente en numerosos estudios como modelo de lesión nerviosa52, donde se ha demostrado que la degradación axonal después de la lesión puede ser similar a la degeneración walleriana en mamíferos53. Por lo tanto, nuestro conjunto de herramientas de imágenes a largo plazo podría usarse en el futuro para probar intervenciones farmacológicas que puedan ralentizar o prevenir la degeneración axonal inducida por lesiones en los circuitos motores.

Al analizar la actividad de las neuronas descendentes y ascendentes en el conector cervical torácico luego de la ingestión de cafeína, no observamos grandes cambios en la actividad neuronal en la condición de cafeína en baja concentración, a pesar de los cambios de comportamiento informados previamente45. Por otro lado, observamos grandes ondas de actividad neuronal luego de la ingestión de una solución de cafeína de alta concentración. Algunas moscas tenían varias de estas ondas, lo que sugiere que no se deben a la liberación de calcio de un proceso de muerte celular terminal. Sin embargo, el origen de esta dinámica del calcio sigue sin estar claro. Por ejemplo, se ha demostrado que la cafeína induce la liberación citoplasmática de las reservas internas de Ca2+54. Aunque esto puede ser poco probable en el caso de la ingestión de cafeína, aún no está claro si las ondas de actividad que se propagan temporalmente son el resultado de dicho mecanismo o de la activación neuronal profunda y podría ser el foco de futuros estudios que utilicen estas herramientas. En particular, observamos que los animales no se recuperaron después de alimentarse con nuestra solución de cafeína de alta concentración. Sin embargo, esta prueba de concepto ilustra cómo las imágenes a largo plazo en Drosophila pueden usarse en el futuro para detectar el impacto de la ingestión de drogas en la dinámica neuronal en el comportamiento de los animales.

Con base en estos estudios de casos exitosos, prevemos que nuestros dispositivos de imágenes a largo plazo creados con microingeniería se pueden aprovechar para estudiar una variedad de preguntas y desafíos adicionales. Por ejemplo, uno podría aplicar estos dispositivos para registrar la progresión de la muerte celular en modelos de Drosophila de trastornos neuronales como la enfermedad de Parkinson55. Nuestra línea de fabricación de implantes también es generalizable. Por lo tanto, las formas de los implantes podrían adaptarse para abordar otros desafíos experimentales, incluida la orientación de los circuitos de los ganglios abdominales que regulan la receptividad de apareamiento en las hembras56. Además, los implantes podrían modificarse para almacenar y liberar componentes activos que, por ejemplo, administren compuestos a la hemolinfa de manera controlada. Finalmente, se pueden tomar medidas adicionales para automatizar la implantación, por ejemplo, abriendo la cutícula torácica usando un láser excimer UV57, o desarrollando técnicas de manipulación robótica para desplazar automáticamente los órganos torácicos, colocar el implante y sellar el orificio torácico con una ventana58.

En resumen, los desarrollos tecnológicos presentados en este trabajo permiten una variedad de experimentos en moscas individuales a través de una amplia gama de escalas de tiempo, lo que permite comprender cómo los sistemas biológicos, en particular los circuitos motores y premotores, cambian durante el envejecimiento o la progresión de la enfermedad, siguiendo lesión, aprendizaje o experiencias sociales, en respuesta a cambios en el estado interno, o como consecuencia de la ingestión de alimentos o drogas. Estos datos, a su vez, pueden inspirar el desarrollo de controladores más adaptables para sistemas artificiales que tengan la capacidad de cambiar de forma y función para adaptarse a capacidades y necesidades en constante cambio.

Las ventanas torácicas (discos de polímero transparente) se fabricaron mediante fotolitografía59. Todos los pasos de exposición se realizaron en un alineador de máscara (MJB4, Süss MicroTec, Alemania) usando iluminación i-line. Las máscaras cromadas se fabricaron utilizando un grabador láser directo (VPG-200, Heidelberg Instruments, Alemania) y un procesador automático de máscaras (HMR900, HamaTech, Alemania). Las dimensiones de las estructuras microfabricadas se midieron utilizando un microscopio óptico (DM8000 M, Leica Microsystems, Suiza) o un perfilador mecánico de superficies (Dektak XT, Bruker Corporation, EE. UU.). El protocolo comenzó con el tratamiento de la superficie de una oblea de silicio de 4 pulgadas con un decapante de plasma (PVA TePla 300, PVA AG, Alemania) a 500 W durante 7 min para reducir su humectabilidad. Se centrifugó una solución acuosa de dextrano al 20 % (p/vol) (MP Biomedicals, MW 60k–90k g/mol) a 1000 rpm (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, EE. UU.) y se horneó a 150 °C durante 2 min para formar una capa de sacrificio soluble en agua de 1 μm de espesor. Esta capa permite que las ventanas se suelten suavemente al final del proceso de fabricación (Figura complementaria 1a-i). Un fotorresistente negativo (SU-8 3025, Kayaku Advanced Materials, EE. UU.) se revistió directamente por rotación en la capa de sacrificio y se horneó suavemente (Figura complementaria 1a-ii). En particular, con este grosor, SU-8 tiene una transmitancia superior al 95 %60 (https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/07/KAM-SU-8-3000-Datasheet-7.10-final .pdf). Después de la exposición, las ventanas se hornearon posteriormente y la resistencia sin curar se eliminó con un desarrollador (acetato de éter metílico de propilenglicol (PGMEA, acetato de 1-metoxi-2-propanol), Sigma-Aldrich, Alemania) (Figura complementaria 1a-iii) . A continuación, la oblea con ventanas SU-8 se recubrió con una capa de fotorresistencia positiva (AZ 40XT) de 20 μm de espesor utilizando un sistema de procesamiento automatizado (ACS200 Gen3, Süss MicroTec, Alemania). Esta capa extra de polímero sirve como máscara física durante el proceso de deposición de metal. Se fabricó una segunda máscara cromada para diseñar identificadores únicos en las ventanas mediante fotolitografía. A continuación, la oblea se recubrió con películas de Ti y Au61 mediante deposición física de vapor (EVA 760, Alliance-Concept, Francia) con un espesor de 3 nm y 15 nm, respectivamente (Fig. 1a-iv complementaria). El desarrollo de la fotoprotección negativa (Remover 1165, Kayaku Adv. Mat., EE. UU.) eliminó todas las capas en la parte superior de las ventanas excepto los números que sirven como marcadores. Finalmente, las ventanas etiquetadas se liberaron disolviendo la capa de sacrificio en agua DI (Figura complementaria 1a-vi). Las ventanas se filtraron, se secaron a temperatura ambiente y se esterilizaron antes de su uso en los experimentos. Las ventanas resultantes eran ópticamente transparentes (Fig. 1b complementaria) y del tamaño apropiado para sellar las aberturas torácicas (Fig. 1c complementaria).

Desarrollamos una técnica de microfabricación de dos niveles para maximizar el rendimiento, proteger los moldes maestros del uso excesivo y facilitar la difusión de la tecnología62,63. Brevemente, los implantes se colaron dentro de plantillas de elastómero que se fabricaron a partir de una oblea grabada que servía como molde maestro. Primero, una oblea de prueba de silicio de cuatro pulgadas (100/P/SS/01-100, Siegert Wafer, Alemania) se trató con hexametildisilazano (HMDS) (número CAS: 999-97-3, Sigma-Aldrich, Alemania) y se deshidrató. a 125 °C para mejorar la adherencia a su superficie. Luego, la oblea se recubrió por rotación con una película de fotorresistencia positiva de 8 μm de espesor (AZ 9260, Microchemicals GmbH, Alemania) utilizando un sistema automático de procesamiento de resistencia (EVG 150, EV Group, Alemania) (Figura complementaria 3a-i). Después de los pasos de cocción, exposición y desarrollo, la oblea se procesó mediante grabado de iones reactivos profundos (DRIE), específicamente un proceso de Bosch,64 (AMS 200 SE, Alcatel) para obtener paredes casi verticales con una alta relación de aspecto (Fig. 3a-ii). La resistencia positiva restante se eliminó en un removedor (Remover 1165, Kayaku Advanced Materials, EE. UU.) a 70 ° C y se limpió enjuagando con agua y secando al aire (Fig. 3a-iii complementaria). Las plantillas de elastómero se fabricaron mediante moldeado de réplica utilizando polidimetilsiloxano (PDMS). El proceso de moldeo de la réplica comenzó con la deposición de vapor de silano (tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil) silano, Sigma-Aldrich, Alemania) sobre la superficie del molde maestro en una cámara de vacío durante 6 h. Silanizion solo se realizó una vez porque forma una capa de silano permanente. El PDMS se preparó como una mezcla (10:1, peso/peso) del elastómero y el agente de curado (número GMID: 01673921, Dow Europe GmbH, Alemania) y se vertió sobre la oblea en una placa de Petri. Para liberar las burbujas atrapadas dentro de los pozos de alta relación de aspecto, el molde se desgasificó usando una bomba de vacío (EV-A01-7, Swiss Vacuum Technologies SA, Suiza) en un desecador de vacío (F42020-0000, SP Bel-Art Labware & Apparatus , EE.UU). Finalmente, el elastómero se curó a 65 ° C durante 5 h en un horno (UF30, Memmert GmbH, Alemania) y se despegó la losa de PDMS (Fig. 3b complementaria). Usando marcadores de alineación como guía, la losa se cortó en varias piezas con una hoja de afeitar para que sirvieran como plantillas con las que luego se podrían fabricar implantes (Fig. 3c complementaria).

Los implantes flexibles se fabricaron a partir de un polímero fotocurable (Ostemer 220, Mercene Labs AB, Suecia). La polimerización ocurre cuando una mezcla de dos componentes (Parte A y Parte B) se exponen a la luz ultravioleta (Fig. 4a-i complementaria). La plantilla de PDMS se silanizó (tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano, Sigma-Aldrich, Alemania) durante 1 h en un desecador de vacío (Figura complementaria 4a-ii). La parte A se calentó a 48 °C durante la noche para asegurarse de que no quedaran cristales sin disolver en la solución. La Parte B y el recipiente también se calentaron hasta 48 °C antes de mezclar. A continuación, las partes A y B se mezclaron completamente y la mezcla se desgasificó en una cámara de vacío durante 5 min. Se vertió una gota de 200 μL de la mezcla (1.86:1, wt\wt) sobre la plantilla (Fig. 4a-iv complementaria) y la plantilla se intercaló mecánicamente entre dos portaobjetos de vidrio usando dos clips. El portaobjetos de vidrio que toca el polímero del implante se trató previamente con plasma (PDC-32G, Harrick Plasma, EE. UU.) a 29 W durante 1 min para facilitar la liberación del implante al mejorar la adhesión entre el vidrio y los implantes. La solución se expuso a luz ultravioleta (365 nm, UV9W-21, Lightning Enterprises, EE. UU.) durante 10 minutos para la polimerización (Fig. 4a-v complementaria). Las muestras se rotaron varias veces durante la exposición a los rayos UV para asegurar una reacción homogénea en toda la plantilla. Los implantes se liberaron agitando mecánicamente las plantillas en alcohol isopropílico (IPA) usando un sonicador (DT 100 H, Bandelin Sonorex Digitec, Alemania) (Fig. 4a-vi complementaria). Todo este proceso produjo una oblea con 100 implantes (Fig. 4b, c complementaria) que posteriormente se cortaron con una hoja de afeitar antes de la implantación.

Diseñamos y construimos un brazo manipulador para desplazar temporalmente los órganos torácicos durante la implantación (Figuras complementarias 5a, b). Para construir el brazo, primero imprimimos en 3D un molde que nos permitió pegar un pin de disección (26002-10, Fine Science Tools, Alemania) a la punta de una aguja de jeringa (15391557, Fisher Scientific, EE. UU.) de manera reproducible ( Figura complementaria 5c). El alfiler se inserta en la aguja hasta que su punta toque el extremo del molde. Pegamos el alfiler a la aguja con un adhesivo curable por UV (Bondic, Aurora, ON, Canadá). Luego, el brazo se dobló con unas pinzas y se guió por un segundo molde impreso en 3D (Fig. 5d complementaria). El pasador se dobló primero en forma gruesa y luego se ajustó más finamente utilizando el molde impreso en 3D. Luego se usó otra pieza impresa en 3D para conectar la aguja de la jeringa a un micromanipulador de 3 ejes (DT12XYZ, ThorLabs, EE. UU.) y a una etapa de extensión (Fig. 5a complementaria). Luego, toda la estructura se adjuntó a una placa de prueba (MB1224, ThorLabs, EE. UU.) (Fig. 5b complementaria).

Usamos escritura láser directa65 para fabricar un mecanismo compatible personalizado que mantiene a las moscas en su lugar durante la microscopía de dos fotones. El mecanismo fue diseñado utilizando un software CAD 3D (SolidWorks 2021, Dassault Systémes, Francia). Se usó una oblea de silicio cortada en cubos de 25 mm × 25 mm como sustrato sobre el que se imprimieron las estructuras. La superficie del sustrato se trató con plasma a 500 W durante 7 min y se recubrió con una solución acuosa de poli(ácido acrílico) al 10 % (peso/vol) (MW 50000, Polysciences, EE. UU.) a 2000 rpm durante 15 s usando un centrifugador -recubridor (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, EE. UU.) (Fig. 6a-i-iii complementaria). El mecanismo se fabricó utilizando un escritor láser directo (Photonic Professional GT +, Nanoscribe GmbH, Alemania) que controla la polimerización de dos fotones (Fig. 6a-iv complementaria). Se eligió un polímero (IP-S, Nanoscribe GmbH, Alemania) como material de impresión debido a su módulo de Young de 4,6 GPa66 y la resolución a la que se podían imprimir las estructuras. El diseño general se segmentó en varios fotogramas porque el área máxima de escaneo láser proporcionada por un objetivo de 25x (NA 0,8, Zeiss) es de 400 μm. Este enfoque da como resultado una impresión fina sobre un diseño relativamente grande. El objetivo se sumergió en fotoprotector líquido durante la impresión. Al final del proceso de impresión, el polímero sin curar se eliminó con un desarrollador (PGMEA, Sigma-Aldrich, Alemania) durante 20 minutos (Fig. 6a-v complementaria). Finalmente, el PGMEA se enjuagó usando IPA. El mecanismo se liberó del sustrato al disolver la capa de sacrificio en agua DI (Figura complementaria 6a-vi). Esto produjo una estructura microfabricada lo suficientemente grande como para contener el tórax de la mosca (Figura complementaria 6b, c). La etapa de montaje se completó colocando el mecanismo en un marco de aluminio cortado con láser usando pegamento curable con UV (Bondic, Aurora, ON, Canadá).

Los materiales y equipos necesarios para fabricar nuestros dispositivos de microingeniería se resumen en las tablas complementarias 2 y 3.

Los pasos necesarios para preparar moscas para imágenes VNC a largo plazo se describen aquí (Fig. 1e, los órganos internos se han esbozado utilizando datos de la referencia 67). Consulte la Película complementaria 2 para obtener más detalles.

Una mosca fue anestesiada en frío durante 5 min. Luego se colocó en la parte inferior de una platina de disección y se retiraron sus alas cerca de su base usando unas pinzas. Luego, se presionó el tórax a través de un orificio (Etchit, Buffalo, MN) en la cuña de acero del escenario (McMaster-Carr, EE. UU.; acero inoxidable de 0,001", recocido suave tipo 316; pieza n.° 2317K11). Posteriormente, se invirtió el escenario. y se colocó una pequeña gota de pegamento curable con UV (Bondic, Aurora, ON Canadá) sobre el escutelo, para fijar la mosca en su lugar.

El escenario se llenó con solución salina (Tabla complementaria 1). A continuación, se usó una aguja de jeringa de 30 G para cortar un pequeño orificio rectangular (más pequeño que la ventana de 600 μm de diámetro) en la cutícula torácica dorsal. El agujero se hizo insertando la aguja en el tórax posterior cerca del escutelo. Luego se cortaron tres líneas en el tórax lateral y anterior. Se cortó una línea final para completar una abertura rectangular. A continuación, se eliminó el trozo de cutícula resultante con unas pinzas.

Los IFM degradados residuales se extrajeron del tórax abierto usando fórceps. Luego, se usó una aguja de vidrio estirada (P-1000, Sutter instrument, EE. UU.) (30-0018, Harvard Apparatus, EE. UU.) para separar pequeños enlaces traqueales entre una gran parte de la tráquea y el lado izquierdo del intestino. A continuación, también se extirpó la glándula salival izquierda con unas pinzas.

El brazo manipulador se colocó en la parte superior del escenario con su punta visible. La etapa de disección se colocó con la cabeza de la mosca apuntando hacia el experimentador. Luego, la punta del brazo se insertó en el tórax utilizando un manipulador de 3 ejes (DT12XYZ, ThorLabs, EE. UU.). A continuación, se insertó la punta del brazo en el lado derecho (del experimentador) del intestino cerca de la mitad del proventrículo. La punta se insertó lo suficientemente profundo como para estar debajo del buche y las glándulas salivales, pero sin tocar el VNC. Una vez que la punta del brazo estuvo en el lado derecho de la glándula salival, buche y tripa, se jaló hacia el lado izquierdo de la cavidad torácica, dejando un espacio para el implante cerrado.

Una vez que los órganos de las moscas se sujetaron de forma segura en el lado izquierdo de la cavidad torácica con el brazo de manipulación, el implante se cerró en el aire con unas pinzas y luego se transfirió a la solución salina que llenaba la etapa de disección. Luego, el implante cerrado se colocó frente a la mosca en el escenario. A continuación, se utilizó un par de pinzas más delgadas para insertar el implante en el tórax del animal. Finalmente, se utilizó una aguja de vidrio para ajustar la ubicación del implante y mantenerlo a la altura adecuada, permitiendo que se abriera pasivamente. Una vez abierta, se usó la aguja de vidrio para presionar suavemente el lado izquierdo del implante hacia la parte inferior del tórax mientras se retiraba el brazo y para eliminar las burbujas del implante.

Una vez que el implante estuvo bien posicionado, se utilizó una aguja de jeringa (15391557, Fisher Scientific, EE. UU.) para retirar la solución salina del escenario. Luego se colocó una ventana en la parte superior del orificio cuticular y se centró con el número de identificación en la parte posterior del tórax cerca del escutelo. Luego se usó un alambre para agregar pequeñas gotas de pegamento curable con UV entre la ventana y la cutícula torácica circundante, comenzando desde el lado derecho del escutelo y terminando en el lado izquierdo. A continuación, se volvió a añadir solución salina a la plataforma. El pegamento UV curado, que previamente ataba la mosca al escenario, se eliminó con una aguja. Luego también se eliminó la solución salina y la ventana se selló por completo colocando y curando pegamento UV en la cutícula posterior de la mosca cerca del escutelo.

Una vez que el orificio torácico estuvo completamente sellado por una ventana transparente, la mosca se desmontó de la etapa de disección empujando suavemente la parte delantera del tórax a través del orificio en la cuña de acero. Luego, la mosca se devolvió a un vial de comida para recuperarse.

Todas las moscas se criaron con alimento estándar de harina de maíz en un ciclo de 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad. Los experimentos para cada estudio en particular se realizaron a una hora constante del día para excluir la posibilidad de factores de confusión relacionados con el ritmo circadiano. No se requirió aprobación ética específica para los experimentos con Drosophila. Para la mayoría de los experimentos, se utilizaron moscas hembra porque son de mayor tamaño. Esto aumenta la facilidad de disección, implantación y anclaje. También facilita el procesamiento computacional de imágenes y la detección de la región de interés neuronal.

Se implantaron moscas hembra que expresaban CsChrimson en neuronas descendentes Moonwalker (MDN)28 (UAS-CsChrimson/Act88F-Rpr; VT50660.p65AD(attp40)/+; VT44845.Gal4DBD(attp2)/+) (Fig. 2) a los cinco días. post-eclosión (dpe). Para este experimento, antes de la implantación, los implantes se sumergieron en una solución de dextrano de 30 mg/ml (n.º 31392, Sigma-Aldrich, Suiza) mientras se cerraban mecánicamente. Luego, los implantes se sacaron de la solución y se secaron con un Kimwipe torcido (5511, Kimberly-Clark, EE. UU.). Este paso se realizó para fijar los implantes en una posición cerrada. Sin embargo, más tarde descubrimos que no se requiere dextrano para cerrar los implantes y eliminamos este paso. Luego se colocaron los implantes en el tórax de la mosca como se describe anteriormente. El número de días posteriores a la implantación se indica como "días posteriores a la implantación" (dpi). Se seleccionaron animales de control de la misma edad y sexo del mismo cruce parental. Para los estudios de longevidad, las moscas se alojaron individualmente en viales de alimentos y se evaluaron cada 1 o 2 días.

Los estudios de locomoción se realizaron a 1–3 dpi, 14–16 dpi y 28–30 dpi. Los animales se anestesiaron individualmente con frío y luego se transfirieron a arenas cuadradas redondeadas para la activación optogenética y la grabación de video. Cada registro constaba de 30 s de comportamientos generados espontáneamente (principalmente caminar y acicalarse), seguidos de tres períodos de 3 s de estimulación optogenética a 590 nm (6 mW/cm2) con intervalos entre estímulos de 10 s. Por lo tanto, cada sesión de grabación tuvo una duración de 59 s.

Para procesar los datos de video, se rastrearon los centroides de las moscas usando una versión personalizada de Tracktor68. Luego, sus orientaciones se extrajeron utilizando una red neuronal (implementada en PyTorch69) que se entrenó con datos etiquetados a mano. La red constaba de dos capas convolucionales seguidas de tres capas completamente conectadas. Todas las capas, excepto la final, fueron seguidas por una función de activación de ReLU70. También aplicamos abandono después de las dos primeras capas completamente conectadas con una probabilidad de 0,271. Para entrenar la red, anotamos a mano un total de 300 muestras en tres orientaciones (cabeza arriba, cabeza abajo y de lado). Luego, las imágenes en escala de grises se recortaron utilizando las ubicaciones del centroide de Tracktor y se redimensionaron a 32 × 32 píxeles. Durante el entrenamiento, aplicamos aleatoriamente transformaciones afines (20 grados de rotación, 5 píxeles de traducción y factor de escala de 0,2), aumentos de volteo horizontal y vertical con una probabilidad de 0,5. Usamos el paquete torchvision de PyTorch para todos los aumentos de datos. La red fue entrenada con pérdida de entropía cruzada usando el 80% de los datos. Utilizamos un optimizador de Adam con una tasa de aprendizaje de 0,001, sin caída de peso ni caída de la tasa de aprendizaje72. Entrenamos durante 1000 épocas y seleccionamos los pesos con el mejor error de prueba.

Las velocidades de traslación se calcularon aplicando un filtro Savitzky-Golay de segundo orden con una derivada de primer orden a las posiciones del centroide. El signo de los valores de velocidad se fijó en negativo para movimientos contrarios a la dirección de avance del animal. Las moscas que chocaron con las paredes de la arena durante más de 0,3 s durante el período de estimulación se excluyeron del análisis. Las moscas que se voltearon dorsalmente (es decir, caminaron sobre el techo revestido en sigma) durante el período de estimulación también se excluyeron del análisis. La métrica de "pendiente de respuesta al caminar hacia atrás" se calculó como la aceleración desde el comienzo de cada período de estimulación hasta la velocidad mínima (velocidad máxima hacia atrás) alcanzada en ese período. La métrica de "distancia recorrida caminando hacia atrás" se calculó como la suma de Riemann izquierda de las curvas de velocidad durante cada período de estimulación. Solo consideramos fotogramas donde la velocidad era negativa. Finalmente, la 'Velocidad traslacional negativa máxima' es el valor mínimo de velocidad alcanzado en cada período de estimulación.

Para los estudios de supervivencia y comportamiento de los machos, se implantaron animales que expresaban Reaper en sus músculos de vuelo indirecto (Act88F-Rpr; UAS-GFP; +/+) 1 día después de la eclosión (dpe). Se seleccionaron animales de control emparejados por edad y sexo ('Intactos') del mismo cruce parental. Las moscas se alojaron individualmente en viales de comida y se voltearon todos los días en un nuevo vial de comida mientras se evaluaba su longevidad (Fig. 10 complementaria). Se registró el comportamiento espontáneo de tres machos por grupo. Estos machos fueron anestesiados individualmente con frío y luego transferidos a arenas cuadradas redondeadas para grabaciones de video. Cada grabación consta de 60 s de comportamientos generados espontáneamente.

Las moscas hembra que expresan GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Fig. 1h) se implantaron en 4-6 dpe y se mantuvieron individualmente en viales de alimentos. A 1–3 dpi, 14–16 dpi y 28–30 dpi, las moscas se ataron a una plataforma de montaje y se adquirieron 25 volúmenes de imágenes de 100 μm de profundidad (tamaño de paso de 1 μm) usando un microscopio de dos fotones (microscopio Bergamo II, ThorLabs, EE. UU.) y un láser de 930 nm (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, EE. UU.) con 20 mW de potencia en el lugar de la muestra. Adquirimos 0,1 volúmenes por segundo (vps) usando un escáner Galvo-Resonance23. Luego, las 25 imágenes por profundidad se registraron entre sí usando el módulo HyperStackReg en Fiji73 y una transformación de cuerpo rígido. Estas imágenes registradas se proyectaron a continuación a lo largo del eje del tiempo en una imagen de desviación estándar. El volumen resultante se codificó con colores de profundidad utilizando la macro Temporal-Color de Fiji.

Para experimentos en moscas macho, tomamos imágenes de animales que expresan GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Fig. 10 complementaria). Estos animales se implantaron a 1 dpe y se mantuvieron individualmente en viales de alimento. A 1 dpi, 5 dpi y 10 dpi, se ataron moscas y se realizó un registro volumétrico de la VNC utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 11 mW de potencia láser. Las moscas se anestesiaron con dióxido de carbono (1,3 l/min) aplicado ventralmente mientras se registraban los volúmenes de imágenes. Los volúmenes consistieron en cuadros de 512 × 512 píxeles tomados cada 1 μm sobre una profundidad total de 100 μm. Luego se generaron proyecciones Z con codificación de colores de profundidad utilizando la macro 'Color temporal' de Fiji.

Se implantaron moscas que expresaban GCaMP6f y tdTomato en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) a 5 dpe (hembra) o 1 dpe (macho) y luego se montaron en el platina de formación de imágenes de dos fotones a 1, 5 y 10 ppp (hembra, película suplementaria 4; macho, película suplementaria 5). Se adquirió un plano de imagen horizontal del neurómero protorácico usando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 25 mW de potencia. Se adquirieron tres imágenes horizontales del plano z utilizando un escáner Galvo-Resonance y se promediaron en un cuadro a una velocidad de imagen de 10,7 fps. Los cuadros de comportamiento se adquirieron simultáneamente (como en la referencia 23) a una velocidad de 80 fps.

Se implantó una mosca hembra que expresaba GCaMP6f y tdTomato en neuronas descendentes de ADN0123,48 (Act88F-Rpr/+; GMR22C05-AD-spGal4/UAS-GCaMP6f; GMR56G08-DBD-spGal4 / UAS-tdTomato) a los 3 dpe. A continuación, se montó la misma mosca en la platina del microscopio de dos fotones a 1, 3 y 5 ppp. Se adquirió un plano de imagen horizontal del neurómero protorácico utilizando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 28 mW de potencia láser. Las imágenes del plano horizontal se adquirieron utilizando un escáner Galvo-Galvo a una velocidad de imagen de 5,6 fps. Los cuadros de comportamiento se adquirieron simultáneamente (como en la referencia 23) a una velocidad de 80 fps. AxoID se utilizó para detectar las neuronas como regiones de interés (ROI) en imágenes de microscopio de dos fotones y extraer sus valores de fluorescencia50. El clasificador de eventos de fluorescencia neuronal semiautomatizado descrito en la ref. 50 se utilizó para detectar eventos de actividad neuronal a partir de trazas de fluorescencia. Luego se correlacionaron con rotaciones esféricas en cinta rodante.

Para ilustrar cómo se podrían usar otros diseños de implantes para obtener acceso óptico a las regiones posteriores del VNC (Fig. 9 complementaria), una mosca hembra que expresa GFP en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) se diseccionó a los 3 dpe. Se polimerizó una gota de pegamento UV en la punta de un implante. La implantación también se modificó ligeramente: una vez insertado en el tórax de la mosca, el implante se empujó hacia atrás con el pegamento curado descansando contra la cutícula interior del escutelo, fijando el implante en su posición. Luego se cerró la mosca usando una ventana transparente. Se registró un volumen de imágenes (576 × 576 píxeles y 100 μm de profundidad) del VNC utilizando un microscopio de dos fotones con un escáner Galvo-Galvo a 930 nm con 22 mW de potencia láser.

Se implantaron moscas hembra que expresaban GFP en sus órganos cordotonales (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Fig. 3) en 1 dpe. Se registró una pila z del VNC a 1 ppp, usando un microscopio de dos fotones a 930 nm con 55 mW de potencia láser. Las moscas se anestesiaron con dióxido de carbono (1,8 l/min) suministrado ventralmente mientras se registraban las pilas z. Z-stacks constaba de cuadros de 576 × 384 píxeles tomados cada 1 μm sobre una profundidad total de 100 μm (es decir, 100 cuadros por volumen). A continuación, se extrajo la pata delantera izquierda en la articulación tórax-coxa utilizando unas tijeras de disección (n.º 15300-00, Fine Science Tools, Alemania). Luego se registró inmediatamente una segunda pila z. Las moscas se mantuvieron individualmente en viales de comida y se tomaron imágenes todos los días usando los mismos parámetros de registro hasta 15 dpi. A continuación, se utilizó la alineación de pila lineal de Fiji con el complemento de registro SIFT74 para registrar todas las pilas z proyectadas en la primera pila z. A continuación, se utilizó un script de Python personalizado para dibujar y extraer la fluorescencia media de regiones específicas de interés. La fluorescencia media dentro de estas regiones se midió para cada día y se normalizó entre animales dividiéndolas por la fluorescencia media del primer día.

Los sistemas nerviosos de las moscas se diseccionaron y se fijaron con paraformaldehído (441244, Sigma-Aldrich, EE. UU.) a 20 ppp. Las muestras se tiñeron contra nc82 con anticuerpo primario anti-nc82 de ratón diluido a 1:20 en solución de PBST y luego se siguió con anticuerpo secundario conjugado con Alexa 633 anti-ratón de cabra diluido a 1:500 (procedimiento detallado descrito en la referencia 23). Esto nos permitió adquirir imágenes confocales que incluían puntos de referencia del neuropilo y expresión de GFP endógena. Se utilizó el software Zen 2011 14.0 para adquirir imágenes confocales. Las intensidades del láser confocal y las ganancias de PMT se seleccionaron manualmente para evitar la saturación de píxeles. Estas pilas z confocales luego se proyectaron en 2D utilizando la proyección de desviación estándar de Fiji. La proyección de desviación estándar de la expresión de GFP se muestra como una imagen invertida (Fig. 3c, d). Se escribió un script de python personalizado para detectar los límites del VNC utilizando la proyección de desviación estándar de las imágenes nc82. Este contorno se detectó utilizando la biblioteca Open CV y ​​luego se dibujó en imágenes de proyección de desviación estándar GFP.

Moscas hembras (5 dpe) expresando un indicador de calcio, GCaMP6f, y un marcador anatómico, tdTomato, en todo el sistema nervioso (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) (Fig. 4) pasaron hambre durante 21 a 23 h en un Kimwipe húmedo (5511, Kimberly-Clark, EE. UU.). Luego se implantaron sin ventana torácica y se mantuvieron en la etapa de disección (aquí no se usó la etapa de montaje) para limitar el número de intervenciones. Luego, los animales se colocaron bajo un microscopio de dos fotones donde podían caminar en una cinta rodante esférica que consistía en una bola de espuma (Last-A-Foam FR7106, General Plastics, EE. UU.) Sostenida por aire (0,8 L/min) con un diámetro de 1 cm23. A continuación, se tomaron imágenes de las secciones transversales coronales de su conectivo cervical a 930 nm con una potencia de láser de 15 mW. Logramos una velocidad de imagen de 16 fotogramas por segundo (fps) mediante el uso de un escáner Galvo-Resonance. Paralelamente se registró el comportamiento de las moscas mediante siete cámaras a 80 fps. Las rotaciones de la bola también se midieron a lo largo de tres ejes utilizando dos sensores de flujo óptico6,23. Registramos la actividad neuronal y el comportamiento en ensayos de ~4 min cada uno. En primer lugar, se registraron cuatro ensayos. Luego, se bajó la bola de espuma y se continuó con el registro mientras las moscas se alimentaban de una solución que consistía en (i) 1 ml de agua desionizada, 8 mg de sacarosa (A2188.1000, Axon Lab, Suiza) y 1 mg de colorante amaranto (A1016, Sigma-Aldrich, EE. UU.), (ii) una solución de cafeína de baja concentración que consta de 1 ml de agua desionizada, 8 mg de cafeína (C0750, Sigma-Aldrich, EE. UU.), 8 mg de sacarosa y 1 mg de amaranto, o (iii) una solución de alta Solución de cafeína sobresaturada de concentración que consta de 1 ml de agua desionizada, 40 mg de cafeína, 8 mg de sacarosa y 1 mg de amaranto. Los animales fueron alimentados utilizando una aguja de vidrio estirada (P-1000, Sutter instrument, EE. UU.; parámetros del extractor: Calor: 502; Tracción: 30; Velocidad: 120; Tiempo: 200; Presión: 200). Se añadió una pequeña gota de pegamento curable por UV (Bondic, Aurora, ON Canadá) cerca de la punta de la aguja para evitar que la solución se desplazara hacia arriba por la aguja. La aguja se colocó frente a las moscas usando un manipulador (uMp-3, Sensapex, Finlandia). Después de la alimentación, la cinta rodante esférica se reposicionó debajo de la mosca y se adquirieron ocho ensayos de imágenes más.

Usamos código Python personalizado a menos que se indique lo contrario. Para todos los análisis de imágenes, el eje y es ventral-dorsal a lo largo del cuerpo de la mosca y el eje x es medial-lateral. Los tamaños de kernel de imagen y filtro se especifican como (y, x) en unidades de píxeles. Las grabaciones del conectivo cervical torácico sufren un gran movimiento entre fotogramas, incluidas grandes traslaciones, así como deformaciones más pequeñas no afines. Debido a que los indicadores de calcio (p. ej., GCaMP6f) están diseñados para tener una fluorescencia de referencia baja, su uso es un desafío para la corrección de movimiento. Por lo tanto, confiamos en las señales de la proteína fluorescente roja coexpresada, tdTomato, para registrar las imágenes del canal PMT rojo (tdTomato) y verde (GCaMP6f). Primero, realizamos el registro del centro de masa (COM) de cada fotograma grabado para eliminar grandes traducciones y recortamos las regiones de fondo alrededor del cuello conectivo (de 480 × 736 a 352 × 576). Luego, calculamos el campo de movimiento de cada cuadro rojo en relación con el primer cuadro grabado usando flujo óptico y corregimos los cuadros rojo y verde para el movimiento usando interpolación bilineal. El algoritmo para la corrección del movimiento del flujo óptico se describió previamente en la ref. 23. Solo usamos el componente de flujo óptico para calcular los campos de movimiento y omitimos la restricción de coincidencia de características. Regularizamos el gradiente del campo de movimiento para promover la suavidad (λ = 800). El código de Python para el paquete de corrección de movimiento de flujo óptico (ofco) se puede encontrar en https://github.com/NeLy-EPFL/ofco.

Observamos que los valores absolutos de fluorescencia eran ligeramente más bajos en el lado derecho del conectivo que en el lado izquierdo, probablemente debido a la dispersión de los órganos torácicos que son empujados hacia la derecha por el implante. Para corregir esta fluorescencia absoluta desigual, calculamos la media de todos los fotogramas corregidos por movimiento a lo largo del tiempo. Luego, filtramos la imagen resultante con un filtro medio y de paso bajo (filtro mediano: (71,91), filtro gaussiano: σ = 3) para eliminar las características de las neuronas individuales y conservar solo los cambios espaciales globales en la fluorescencia. Luego calculamos la media en el eje y para obtener un perfil de fluorescencia en el eje x (izquierda - derecha) y ajustamos una línea recta a los 200 píxeles más centrales. Para corregir la disminución de la fluorescencia hacia el lado derecho, multiplicamos la fluorescencia con el valor inverso de este ajuste de línea recta al perfil del eje x. Tenga en cuenta que esta corrección solo ayuda en la visualización de la fluorescencia y no tiene ningún impacto en el cálculo de ΔF/F porque, para un píxel determinado, tanto la fluorescencia en cada punto de tiempo como su fluorescencia de referencia se multiplican por la misma constante. factor.

Para eliminar el ruido de los datos registrados y corregidos, utilizamos una versión adaptada del algoritmo DeepInterpolation75. Brevemente, DeepInterpolation utiliza una red neuronal para eliminar el ruido de una imagen de microscopía "interpolándola" desde cuadros temporalmente adyacentes. Una U-Net se entrena sin supervisión utilizando 30 fotogramas (alrededor de 2 s) antes y 30 fotogramas después del fotograma de destino como entrada y el fotograma actual como salida. Por lo tanto, el ruido independiente se elimina de la imagen y se conservan los componentes que evolucionan dinámicamente a lo largo del tiempo. Modificamos el procedimiento de entrenamiento para que quepa un lote en la RAM de 11 GB de una tarjeta gráfica Nvidia GTX 2080TI: en lugar de usar el marco completo (352 × 576 píxeles), usamos un subconjunto de la imagen (352 × 288 píxeles) durante el entrenamiento. Seleccionamos aleatoriamente la coordenada x del subconjunto. Durante la inferencia, usamos la imagen completa. Verificamos que el uso de diferentes tamaños de imágenes durante el entrenamiento y la inferencia no cambió la imagen sin ruido resultante fuera de las regiones fronterizas. Entrenamos un modelo para cada mosca utilizando 2000 marcos seleccionados al azar de una de las pruebas antes de alimentarlos y lo aplicamos a todos los marcos posteriores. Los parámetros de entrenamiento se describen en la Tabla 1. El algoritmo DeepInterpolation adaptado se puede encontrar en la rama "adapttoR57C10" del siguiente repositorio de GitHub: https://github.com/NeLy-EPFL/deepinterpolation

Mostramos los valores de fluorescencia como ΔF/F (Películas complementarias 10–12). Esto se calculó como \({{\Delta }}F/F=\frac{F-{F}_{0}}{{F}_{0}}\), donde F es la fluorescencia variable en el tiempo y F0 es la línea de base de fluorescencia en píxeles. Para calcular F0, aplicamos un filtro gaussiano espacial (σ = 10) a las imágenes y convolucionamos cada píxel con una ventana temporal de 10 muestras (alrededor de 0,6 s). Luego identificamos la fluorescencia mínima de cada píxel en todos los ensayos.

Se han utilizado sensores de flujo óptico para medir las rotaciones esféricas de la cinta rodante6,23, pero son inherentemente ruidosos. Por lo tanto, calculamos el promedio móvil de 80 muestras (alrededor de 200 ms). A partir de los valores de los sensores preprocesados, calculamos las velocidades de avance, lateral y de giro6. Clasificamos los períodos estacionarios (sin movimientos de la pelota) como períodos en los que los valores de flujo óptico absoluto de las velocidades de rotación de la cinta esférica estaban por debajo de un umbral de \(0.31 {{{{{{{{\rm{ms}}}}}} }}}^{-1}\widehat{=}0,01\) rotaciones/s y al menos el 75 % de los fotogramas dentro del tiempo de ± 0,5 s de la muestra estaban por debajo de este umbral. Este último criterio aseguraba que se excluyeran los breves períodos estacionarios entre episodios de caminata.

Registramos tres modalidades de datos diferentes en tres frecuencias de muestreo diferentes: los datos de imágenes de dos fotones se registraron a ~ 16 Hz, las imágenes de comportamiento de siete cámaras se adquirieron a 80 Hz y los movimientos de la pelota con dos sensores de flujo óptico se midieron a casi 400 Hz. Por lo tanto, para sincronizar estas mediciones para un análisis posterior, tomamos muestras de todas las mediciones a la velocidad de fotogramas de imágenes de dos fotones promediando todas las muestras de comportamiento y rotación de la bola adquiridas durante un fotograma de dos fotones.

Para calcular los rastros de fluorescencia normalizados para cada prueba, como se muestra en la Fig. 4e, promediamos la fluorescencia en todo el conectivo cervical y calculamos el percentil del 99 % de esta serie temporal durante las pruebas antes de la alimentación. Luego normalizamos la serie temporal de todos los ensayos registrados desde esa mosca al percentil de prealimentación del 99 %. Para realizar el análisis estadístico, utilizamos la fluorescencia normalizada y calculamos el máximo (límite superior del percentil del 99%) dentro de ciertos períodos de tiempo antes, durante y después de la alimentación. Antes de la alimentación, la fluorescencia máxima normalizada es la unidad para cada una de las 9 moscas, como se esperaba de la normalización del percentil. Para períodos durante, <9 min después, <19 min después, <29 min después y <38 min después de la alimentación, realizamos pruebas U de Mann-Whitney para determinar si la actividad neuronal máxima después de la ingestión alta de cafeína fue significativamente diferente de la máxima. actividad después de la ingestión baja de sacarosa o cafeína (Fig. 4g). Con el objetivo de aplicar la menor cantidad o preprocesamiento necesario, hasta este punto, usamos datos de fluorescencia que no se eliminaron con DeepInterpolation. Sin embargo, en este caso, para analizar la sincronización precisa de las ondas, aplicamos DeepInterpolation como se describe anteriormente. Esto reduce la fluorescencia de fondo y el ruido de alta frecuencia. Para analizar la progresión temporal de las ondas de fluorescencia, primero identificamos el momento del pico de fluorescencia en todo el Tpico conectivo cervical. Todos los tiempos se dan en relación con el tiempo de ese pico, lo que permite un análisis de las diferencias de tiempo precisas. Luego calculamos la fluorescencia media a lo largo del tiempo dentro de las regiones de interés seleccionadas manualmente (conectivo dorsal, lateral y ventral, así como neuronas de fibra gigante) y las representamos normalizadas a sus valores mínimos y máximos. Suavizamos la serie temporal con un filtro gaussiano (\(\sigma=3\widehat{=}0.18\) s). Para identificar el tiempo pico de cada píxel, aplicamos un filtro gaussiano temporal (\(\sigma=10\widehat{=}0.62\) s) y un filtro gaussiano espacial (σ = 1) y buscamos el valor máximo de fluorescencia dentro de Tpeak ± 10 s. En la Fig. 4f mostramos la fluorescencia media durante los períodos en que la mosca estaba estacionaria (es decir, sin mover la pelota).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar generados en este estudio se han depositado en un repositorio público disponible en: https://dataverse.harvard.edu/dataverse/long_term_imaging_vnc_drosophila. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los códigos personalizados utilizados para analizar los datos sin procesar están disponibles en: https://github.com/NeLy-EPFL/Long-Term-Imaging-VNC-Drosophilahttps://doi.org/10.5281/zenodo.6826488.

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Agradecemos a Alain Herzog por fotos y videos de animales implantados. LH reconoce el apoyo de una subvención EU H2020 Marie Skłodowska-Curie (754354). JB reconoce el apoyo de un estipendio de doctorado de Boehringer Ingelheim Fonds. VLR agradece el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México, CONACYT, bajo el número de subvención 709993. SG reconoce el apoyo de una subvención EPFL SV iPhD. FA reconoce el apoyo de un estipendio de doctorado de Boehringer Ingelheim Fonds. MSS reconoce el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 714609). PR reconoce el apoyo de una subvención del Proyecto SNSF (175667) y una subvención SNSF Eccellenza (181239).

Estos autores contribuyeron igualmente: Laura Hermans, Murat Kaynak.

Laboratorio de neuroingeniería, Instituto Brain Mind e Instituto de Bioingeniería, EPFL, Lausana, Suiza

Laura Hermans, Jonas Braun, Victor Lobato Rios, Chin-Lin Chen, Adam Friedberg, Semih Günel, Florian Aymanns & Pavan Ramdya

Laboratorio de Sistemas Microbiorobóticos, Instituto de Ingeniería Mecánica e Instituto de Bioingeniería, EPFL, Lausana, Suiza

Laura Hermans, Murat Kaynak y Mahmut Selman Sakar

Laboratorio de Visión por Computador, EPFL, Lausana, Suiza

Semih Gunel

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Correspondencia a Mahmut Selman Sakar o Pavan Ramdya.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Davide Raccuglia y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Hermans, L., Kaynak, M., Braun, J. et al. Los dispositivos de microingeniería permiten obtener imágenes a largo plazo del cordón nervioso ventral en el comportamiento de Drosophila adulta. Nat Comun 13, 5006 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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Recibido: 13 noviembre 2021

Aceptado: 04 agosto 2022

Publicado: 25 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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